【行业动态】外泌体速通手册


May 15, 2019

01

概念

 

Exosome,中文名外泌体是一种能被大多数细胞分泌的微小膜泡,具有脂质双层膜结构,直径大约40-120 nm。尽管外泌体最初在1983年就被发现,但人们一直认为它只是一种细胞的废弃物。然而最近几年,人们发现这种微小膜泡中含有细胞特异的蛋白、脂质和核酸,能作为信号分子传递给其他细胞从而改变其他细胞的功能。这些发现点燃了人们对细胞分泌膜泡的兴趣。最近的研究发现外泌体在很多生理病理上起着重要的作用,如免疫中抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤的修复等。不同细胞分泌的外泌体具有不用的组成成分和功能,可作为疾病诊断的生物标志物。外泌体具有脂质双层膜结构,能很好的保护其包被的物质,且能靶向特定细胞或组织,因此又是一种很好靶向给药系统(targeted delivery system)。

图1.png

外泌体可大致分为3大类:(a)由质膜分裂产生的微囊泡;(b)在内质网内形成并在多囊泡体与质膜融合后释放的外体;(c)凋亡体a作为细胞凋亡过程中的囊泡重新释放。低等生物,如细菌和寄生虫,也能分泌外囊泡。

图2.png

 

02

作用

 

外泌体的产生及其与受体细胞的相互作用

外泌体被认为是由多泡体(MVB)膜向内出芽形成的内吞的囊泡同质群体,涉及转运所需的内复合物(ESCRT)和其他相关蛋白被分选到外泌体中,例如程序性细胞死亡6蛋白(PDCD6IP;也称为ALIX)和肿瘤易感基因101蛋白(TSG101)。除了识别泛素化蛋白质的ESCRT之外,其他ESCRT非依赖性机制也可用于产生某些生化组合物的外泌体。例如,在一些细胞中,外泌体产生需要脂质神经酰胺和中性磷脂酶,将神经-髓磷脂转化为神经酰胺酶。

图3.png

 

外泌体在正常体环境和疾病发病机制中的作用

外泌体可以被认为是生物反应过程中的重要信号体。例如,外泌体可以激活免疫应答或抑制炎症,从而参与免疫监视。在血液循环中,外泌体通过提供用于组装凝血因子的场所而参与血凝反应。在大脑中,神经元可以通过外泌体的分泌进行交流,这有助于近端和远端突触的可塑性。外泌体也参与干细胞维持和可塑性,并且由于它们的抗细胞凋亡和细胞增殖刺激特性,它们似乎在受损组织的修复中具有重要作用。通过使用外泌体作为治疗剂,可以将这些作用转化为治疗。此外,外泌体大多数细胞都可分泌,富含RNA并且能够将其内容物转移到受体细胞的,这表明它们将是非常适合药物递送的候选物,特别是治疗性核酸递送。外泌体的相同特性强调了它们在维持正常生理学中的重要作用,可使它们参与病理反应。例如,外泌体可通过诱导不需要的免疫耐受,传递致癌基因(例如MET),促进核酸转移来支持肿瘤生长和肿瘤相关病理。在出现免疫疾病的情况下,外泌体可以诱导针对自身抗原的免疫应答。外泌体介导的朊病毒蛋白转运也可以推进神经退行性疾病的进展;此外,HIV-1感染也与外囊泡结合病毒进行转移有关。由于它们参与疾病,外泌体被认为是进行治疗的有效靶标。

图4.png

 

 

03

应用

 

鉴于外泌体介导的疾病发病机制的证据越来越多,至少有四种策略可用于影响外泌体驱动的疾病,涉及抑制外泌体功能的各个方面。这些策略包括它们的产生,释放,细胞摄取或靶向促发疾病的特定外泌体组分。抑制外泌体介导的发病机制在癌症中具有原型相关性,其中外泌体与肿瘤发生和肿瘤相关病理学的许多方面密切相关。已经表明,循环外泌体的水平随癌症进展增加超过两倍并且与黑素瘤患者的存活相关。因此,正在开发旨在减少循环外泌体的负荷或阻断外泌体的关键组分的治疗性干预。然而,在此阶段需要谨慎,因为迄今为止大多数体外和体内研究都是使用高浓度的外泌体进行的。下面简单说明治疗策略。

 

抑制外泌体形成

已知各种细胞组分对于外泌体的形成是至关重要的,但是特定的抑制策略还在研发并且在疾病模型中的使用很大程度上未经测试。现阶段使用中性小分子抑制剂或通过用降血压药物阿米洛利(通常减弱内吞囊泡再循环)治疗,抑制神经酰胺形成(在内体分选和外泌体产生中很重要)可以减少外泌体的产量。阿米洛利的使用已被证明在体内通过阻断肿瘤来源的外泌体的分泌来减少小鼠和人类肿瘤细胞的生长是有效的,所述外泌体含有与膜相关的热休克蛋白72HSP72),否则会介导对髓源抑制细胞的免疫抑制作用。

最近的一项研究表明,syndecan proteoglycanssyntenin,它们与PDCD6IP在调节外泌体形成,因此,可以通过RNA干扰(RNAi)或使用小分子抑制剂直接干扰这种相互作用减弱外泌体释放。替代尚未经过测试的方法可能是在空间上阻断特定的跨膜蛋白(例如TSPAN30CD63)。

 

抑制外泌体释放

许多蛋白质与外泌体的分泌有关,但调节外泌体释放的确切机制仍然是难以捉摸的,并且不同细胞情况可能并不相同。在一些肿瘤细胞中,外来体释放依赖于GTPRAB27A,并且已被证明是合理的治疗靶标(使用RNAi)用于减少肿瘤外泌体介导的信号传导以抑制支持肿瘤生长的中性粒细胞。该方法降低了原发性转移癌的生长速率并减少了小鼠肺部肿瘤的转移,在最近一项体内黑素瘤小鼠模型的独立研究已经得到了证实,其中对RAB27A的抑制导致肿瘤生长和转移的减少。其他GTP酶如RAB11RAB35可以作为通过损害多泡体与质膜的对接来抑制外泌体释放的替代靶标。

 

抑制外泌体摄取

已经提出了几种外泌体的摄取机制,但缺乏关于外泌体运输和靶标定义的关键步骤的详细信息。尽管如此,通过阻断受体的磷脂酰丝氨酸可以减弱肿瘤细胞释放的外囊泡的摄取。实际上,该策略降低了小鼠体内人神经胶质瘤异种移植物的生长速率。然而,尽管可行,但该策略的广泛适用性可能因其有限的特异性而受到阻碍与其他生理功能有关。在非肿瘤背景下,通过靶向细胞粘附分子1ICAM1)可以减弱HIV-1T细胞的作用,ICAM1存在于外囊泡包裹的病毒上,从而阻止与β2整合素(LFA1)结合。

 

阻断特定的外泌体成分

研究证明,外囊泡小分子疗法的发展具有重要意义。重要的是要解决干扰外囊泡产生可能导致的脱靶效应,因为外泌体不仅对于正常生理的调节是重要的,而且对许多蛋白质外囊泡的产生同样重要。MSCs的治疗潜力反映在越来越多的正在进行的各种疾病临床试验中,包括心血管疾病,移植物抗宿主病和克罗恩病,以及急性肾损伤(可见ClinicalTrials.gov网站)。

除了上述的几种策略,利用外囊泡本身特性进行治疗的途径也是可行的,例如,治疗性外泌体,利用外泌体的生物活性促进组织再生。这是因为外泌体主要来源于干细胞,能够在静止的内皮细胞中诱导血管生成,抑制细胞凋亡并刺激细胞增殖,传递免疫调节信号,以及收集或重组组织再生所需的细胞。相比之下,来自特异性分化细胞类型(免疫调节细胞)的外泌体可被利用来诱导或抑制特异性免疫反应。药物输送用外泌体,外泌体最有趣的特征可能是它们在细胞间转运各种RNA种类的能力。来自Ratajczak组的早期研究,鉴定了外泌体中的mRNA,这些mRNA来自胚胎干细胞和癌细胞,并且表明可以分别转移到造血祖细胞和单核细胞。随后,在一次这样的研究中,人类肥大细胞衍生的外泌体传递了在小鼠肥大细胞中表达的mRNA,另一项研究中,显示了神经胶质瘤细胞,不仅可以传播受体细胞并转化为蛋白质,分泌带有报告mRNA的微泡,随后在受体细胞中表达。重要的是,在这两项研究中,在外泌体内检测到大量较小的RNA种类 - 特别是miRNAs

 

图5.png外泌体作为治疗靶点

 

图6.png

外泌体作为治疗剂

 

图7.png

用于药物递送的外泌体

 

04

临床应用

 

毫无疑问,外泌体是细胞间通讯的核心,具有治疗潜力。尽管在过去外泌体生物学的研究过程中进行了大量研究,但目前许多特性和机制仍然难以捉摸,依然有很多问题困扰着外泌体的临床应用。例如,已证明MSC衍生的外泌体既抑制又促进肿瘤生长。这种差异可能是在收获外泌体之前细胞培养条件差异的结果,所用纯化方案的差异或由于缺乏稳健的外泌体表征导致的。很明显,环境细胞培养条件会受到影响外泌体的含量。此外,外泌体标准化迫切需要改进。差异超速离心已成为外泌体纯化的金标准; 然而,有人担心囊泡的产量和活性相对较低,因为临床前和临床试验将需要大规模,成本有效和标准化的外泌体生产方案。现阶段还需要充分探索外泌体的生物学并评估潜在危害。后者包括,例如,减轻治疗性外泌体转移对原细胞的潜在危害,不必要的核酸或蛋白质组分转移,有害的免疫系统活化和动物病毒在临床应用前的传播。

直接靶向外泌体以抑制其在介导疾病中的去除效应、利用其固有的潜力来刺激再生反应或将核酸和其他药物运送到靶标中,这已成为重要的新型治疗策略。

 

 

05

市场动向

 

2018.7.19 临床阶段再生医学公司Regeneus宣布美国专利局已通过一项关于Progenza成分和使用的专利,名称为“使用脂肪细胞和细胞分泌物的治疗剂”,美国专利申请编号14/342479。Progenza是Regeneus公司的细胞治疗技术平台,用于治疗骨关节炎和其他肌肉骨骼疾病。它有可能用于治疗当前缺乏治疗手段的其他炎症性疾病。

2018.7.16 生物制药公司NeuroTrauma SciencesLLCNTS)和非营利组织亨利福特医疗集团(Henry Ford Health System)宣布新成立的NTS子公司已获得多年研究赞助和许可协议。这家新公司名为NeurExo SciencesLLCNXS),其目标是推进亨利福特的先驱技术,该技术涉及外泌体作为富含microRNA的细胞外囊泡,用于治疗中风、脑外伤(TBI),包括脑震荡和神经病。

2018.7.24 PureTech Health plc是一家临床阶段的生物制药公司,开发针对脑-免疫-肠道(Brain-Immune-Gut, BIG)轴的新型药物,今天宣布与F. Hoffmann-La Roche LtdHoffmann-La Roche Inc进行多年合作,推进PureTech的乳源外泌体平台技术,用于口服罗氏反义寡核苷酸平台。

2018.9.7 总部位于韩国的ExoCoBio公司在Stem Cell Research and Therapy杂志发表了一篇关于干细胞衍生外泌体的科学论文,实验结果显著缓解了特应性皮炎并抑制了多种炎症靶点。

2018.9.7 英国外泌体治疗应用开发公司Evox Therapeutics公司今天宣布,在B轮融资中募集了3550万英镑(4540万美元)。Evox正在设计外泌体(人体的天然囊泡递送系统),使各种药物(蛋白质、小分子和核酸)能够到达以前难以接近的组织,例如穿过血脑屏障将药物输送到中枢神经系统、细胞内输送生物制剂、以及肝脏RNA治疗药物的递送。

2018.10.13 外泌体检测和表征领域的新兴领导者NanoView Biosciences今天宣布完成由Northpond Ventures领投的1000万美元B轮融资。

2018.10.31 NX Prenatal宣布基于外泌体的早产风险检测进入临床验证。

2019.1.30 Avalon及其子公司Genexosome:全球首个基于唾液外泌体的生物标志物miR-185作为口腔癌的诊断和治疗双重靶点。

2019.3.26 GBI Research的最新报告——外泌体技术:最近在主要参与者CapricorCodiakEvox Therapeutics等,探讨了外泌体技术在制药和医疗保健行业的应用。外泌体行业规模2030年预计将达22.8亿美元。